产品货号:
CZ008
中文名称:
Strep-tag II蛋白纯化磁珠
英文名称:
BalBeads Magshow Strep-Tactin
产品规格:
5ml|50ml|250ml
发货周期:
1~3天
产品价格:
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Strep-Tag系统是模拟链霉亲和素-生物素系统的新型蛋白纯化系统,Strep-Tactin对Strep-Tag II的亲和能力与链霉亲和素相比,至少强10倍以上,且分离纯化条件温和,在生理条件下即可实现蛋白的分离纯化;此外,与其他tag相比,Strep-Tag II为8个氨基酸的小标签(WSHPQFEK),由于标签小,仅为1kDa左右,不影响融合后蛋白质的结构和功能。这些温和的纯化参数能保存蛋白质的生物活性,并仅经一步提取即可产出超过99%的纯度。BalBeads Magshow Strep-Tactin磁珠采用特殊的蛋白偶联工艺,将Strep-Tactin蛋白共价偶联到超顺磁性磁珠表面,制备了一种专为高效、快速分离纯化Strep-tag II蛋白的一种新型功能化材料,实现并搭建了提取速度、提取量及纯度兼得的蛋白纯化平台。
磁珠粒径 | 30~150μm |
配基含量 | ~6mg Strep-Tactin/mL Gel |
融合蛋白结合量 | 1~7mg Strep-tag II蛋白/mL Gel |
悬液浓度 | 10%(v/v)磁珠悬液 |
保存液 | 1×PBS,含0.1%Tween-20 |
可用于从任何表达系统,包括杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌中含有Strep-Tag II标签蛋白的分离纯化。
组分 | 5mL | 50mL | 250mL |
Magshow Strep-Tactin | 5mL | 50mL | 250mL |
说明书 | 1份 |
保存:2~8℃,有效期2年。
- 首次使用本产品前,请务必详细阅读本说明;
- 磁珠使用和保存过程中应避免冷冻、干燥和高速离心等操作;
- 在使用本产品前,请务必充分振荡使磁珠保持均匀的悬浮状态;
- 请选用质量好的移液器吸头和离心管,以免磁珠贴壁或混合过程发生渗漏引起磁珠的损耗;
- 磁珠与溶液混合过程中,如果溶液粘稠无法通过翻转离心管重悬磁珠,可采用移液器反复吹吸或短时漩涡混合使磁珠充分重悬;
- 用户可根据实际需要保留经磁性分离移去的上清液,进行取样检测,以便分析纯化过程和优化蛋白纯化流程;
- 本产品可以重复使用,重复使用时,建议纯化同种蛋白,纯化不同种类的蛋白时,建议使用新的磁珠,以防交叉污染;
- 本产品需与磁性分离器配套使用。
目标蛋白与磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率,各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。以下提供一个较为广泛应用的Strep-Tag II蛋白的纯化流程,用户可参考该操作流程,或者根据自己蛋白的特性自行设计和优化蛋白纯化流程。
- 缓冲配方
- Binding/Washing Buffer:
10mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM EDTA,pH8.0 - Elution Buffer:
5mM desthiobiotin in Binding Buffer - Regeneration Buffer:
5M NaOH or 1mM HABA in Binding Buffer
- Binding/Washing Buffer:
- 样品处理
本说明提供以下三种样品的处理方法:- 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白:表达细胞用适量Binding Buffer稀释,加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1mM的PMSF);冰浴超声裂解细胞,即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠,可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶,在冰上放置30min,以降解核酸。另外,如果目标蛋白含量较低,建议将粗蛋白样品进行离心操作。
- 胞外表达蛋白:取胞外表达上清,用等量Binding Buffer稀释平衡,即为粗蛋白样品。
- 动物细胞胞内表达蛋白:取适量动物细胞,用适量PBS洗涤1次,弃上清;用适量含1%(v/v)Triton X-100或1%(v/v)NP-40的Binding Buffer重悬;加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1mM的PMSF);置于冰上10min,即为粗蛋白样品。
- 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白:表达细胞用适量Binding Buffer稀释,加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1mM的PMSF);冰浴超声裂解细胞,即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠,可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶,在冰上放置30min,以降解核酸。另外,如果目标蛋白含量较低,建议将粗蛋白样品进行离心操作。
- 磁珠预处理
一般情况下,磁珠的使用量是由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得。例如:采用大肠杆菌表达某目标蛋白,250mL发酵液收获1g湿重的菌体,通过预实验估算其目标蛋白产量为~7mg,用户需要取10mL 10%的磁珠悬液用于目标蛋白的纯化。以下即以此为例进行详细说明:- 将拔萝卜磁珠产品置于漩涡混匀器上充分混匀,用移液器取10mL磁珠悬液于离心管中;
- 将离心管置于磁性分离器上,待溶液变澄清后,移去上清液;
- 加入5~10mL Binding Buffer/Washing Buffer到上述装有磁珠的离心管中,盖紧盖子,漩涡振荡15 s,使磁珠重新悬浮。将离心管置于磁性分离器上,磁性分离,移去上清液,重复洗涤2次。
注:在磁性分离过程中,为了减少磁珠在使用过程中的损耗,待溶液变澄清后,盖紧离心管盖子,保持离心管仍在磁性分离器上,手持磁性分离器与离心管上下翻转数次,使澄清的溶液涮洗离心管盖上残留的磁珠,静置片刻,使溶液重新变澄清;以下同。
- 将拔萝卜磁珠产品置于漩涡混匀器上充分混匀,用移液器取10mL磁珠悬液于离心管中;
- 目标蛋白与磁珠结合
- 用10mL Binding Buffer重悬1g湿重的菌体,进行破碎和裂解后,即为粗蛋白样品;
- 将粗蛋白样品转移到装有已预处理磁珠的离心管中,盖紧离心管盖;
- 将离心管置于漩涡混匀器振荡15 s,然后将其置于垂直混合仪上,室温垂直混匀30min(如果需要,可在2~8℃的低温环境下旋转混合约1h,防止目标蛋白降解);
- 将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离,移出上清液到新的离心管中以备后续检测。从磁性分离器上取下离心管进行下一步洗涤步骤。
- 用10mL Binding Buffer重悬1g湿重的菌体,进行破碎和裂解后,即为粗蛋白样品;
- 磁珠洗涤
- 将步骤4的磁珠中加入5~10mL Washing Buffer,漩涡混合2min,磁性分离,移出清洗液到新的离心管中,以备取样检测;
- 继续将上述磁珠中加入5~10mL Washing Buffer,漩涡混合2min,使磁珠重新悬浮,将磁珠悬液转移至新的离心管,避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白污染目标蛋白;磁性分离,移出上清液到收集管,以备取样检测;
- 将步骤4的磁珠中加入5~10mL Washing Buffer,漩涡混合2min,磁性分离,移出清洗液到新的离心管中,以备取样检测;
- 目标蛋白洗脱
- 加入2~5mL Elution Buffer(用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度)于离心管中,盖紧离心管盖,然后将离心管置于垂直混合仪上,室温垂直混合洗脱10min;磁性分离,收集洗脱液到新的离心管中,即为纯化的目标蛋白样品;
- 如果需要,可以重复上述步骤1次,收集样品到新的离心管中,以检测目标蛋白是否洗脱完全。
- 加入2~5mL Elution Buffer(用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度)于离心管中,盖紧离心管盖,然后将离心管置于垂直混合仪上,室温垂直混合洗脱10min;磁性分离,收集洗脱液到新的离心管中,即为纯化的目标蛋白样品;
- 磁珠再生和保存
- NaOH再生:洗脱目的蛋白后的磁珠按照以下顺序进行洗涤:5~10mL纯化水洗涤3次、5~10mL 0.5M NaOH洗涤3次、5~10mL纯化水洗涤至中性,最后加入10mL保存液,将磁珠放置2~8℃环境保存。
- HABA再生:用脱硫生物素洗脱目标蛋白的磁珠还可以用HABA缓冲液再生,加入5~10mL 1mM HABA洗涤磁珠5次,接着用Binding Buffer洗涤磁珠至磁珠本身颜色,每次洗涤5min,最后加入10mL保存液,将磁珠放置2~8℃环境保存。
- NaOH再生:洗脱目的蛋白后的磁珠按照以下顺序进行洗涤:5~10mL纯化水洗涤3次、5~10mL 0.5M NaOH洗涤3次、5~10mL纯化水洗涤至中性,最后加入10mL保存液,将磁珠放置2~8℃环境保存。
以上操作流程适用于大部分Strep-Tag II标签蛋白的纯化,根据目标蛋白与Strep-Tactin蛋白纯化磁珠的结合性能不同,用户可以从以下几个方面对纯化流程进行优化,以提高目标蛋白的回收率和纯度。
- 提高目标蛋白回收率的参考方法:
- 延长蛋白溶液与磁珠孵育的时间;
- 添加合适的蛋白酶抑制剂,防止目标蛋白降解;
- 增加磁珠用量;
- 延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数。
- 延长蛋白溶液与磁珠孵育的时间;
- 提高目标蛋白纯度的参考方法:
- 在纯化过程中添加合适的蛋白酶抑制剂,防止目标蛋白降解;
- 延长洗涤的时间,增加洗涤次数。
- 在纯化过程中添加合适的蛋白酶抑制剂,防止目标蛋白降解;
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